Procedimiento para la detección e identificación de esteroides anabólicos, ß2-agonistas, estimulantes y narcóticos

Desde la década de los sesentas, las organizaciones internacionales competentes prohibieron el uso de ciertos estimulantes del Sistema Nervioso Central en las competiciones. Los esteroides anabólicos fueron incorporados por la Comisión Médica del Comité Olímpico Internacional en la Lista de Sustancias Prohibidas en el año 1974. Sin embargo, la detección e identificación inequívoca de estos compuestos, se logró éxitosamente en la década de los ochentas, con el avance de la tecnología y la incorporación de la Cromatografía Gaseosa acoplada a la Espectrometría de Masas (CG-EM) y el uso de columnas capilares. En el presente trabajo se describe la determinación simultánea de 76 compuestos en orina (esteroides anabólicos, ß2-agonistas, estimulantes y narcóticos) por CGEM. Se describe la cuantificación de los esteroides endógenos, lo que permite establecer el perfil normal de esteroides endógenos y determinar cuándo hay desviaciones de él por el uso de esteroides sintéticos. Además, se presenta la preparación de la muestra que incluye separación por extracción en fase sólida, hidrólisis enzimática, extracción líquido-líquido y la formación de derivados trimetilsilil. El análisis instrumental se realiza por el modo de adquisición monitoreo selectivo de iones, utilizando la retención relativa al patrón interno y los iones característicos de cada compuesto como elemento de identificación primaria. Los limites de detección alcanzados con el procedimiento, se encuentran entre 2 y 10 ng/mL, requisito establecido por la Agencia Mundial Antidopaje. Se describen los factores críticos que influyen en el proceso de extracción, hidrólisis enzimática

Aplicación de las cartas simples de control en el laboratorio antidoping

Las cartas de control son métodos muy utilizados en los laboratorios de ensayo para realizar el control interno del procesamiento analítico de las muestras. Son representaciones gráficas de datos de acuerdo con determinadas reglas de construcción que permiten; entre otras cosas, demostrar el estado del control estadístico del sistema analítico, realizar el seguimiento de un proceso de medición, aportar información sobre aspectos críticos del muestreo y tener un control de la reproducibilidad y repetibilidad del análisis. El presente trabajo muestra de manera sencilla la aplicación de las cartas simples de control, específicamente las gráficas de Shewhart en el control interno de la calidad del laboratorio antidoping. A partir de la observación de una disminución del rendimiento de extracción o recobrado de la androsterona en el procedimiento extractivo para la detección de esteroides anabólicos y otros compuestos, se llevó a cabo un conjunto de ensayos que constituyeron el análisis de causas. Los resultados indicaron una pérdida de la actividad de la enzima β-glucuronidasa empleada en el procedimiento extractivo. Las pruebas encaminadas en este sentido incluyeron la utilización de una disolución de etiocolanolona-glucurónido, cuyos datos fueron referidos a la aparición del sustrato libre del grupo glucurónido. En segundo lugar, fue empleada una enzima de referencia con iguales características. Los resultados del estudio confirmaron la pérdida de la actividad de la enzima β-glucuronidasa (E. coli) empleada en la detección de esteroides anabólicos y otros compuestos en el laboratorio

Characterization of metabolites in urine samples from individuals with a lethal co-administration of cocaine and ethanol

In this paper, cocaine and eleven of its metabolites have been detected and identified in urine samples. The technique was based in a simple liquid-liquid extraction with detection by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The method was validated in terms of repeatability, specificity, recovered, linearity, limit of detection, contamination between samples and robustness, all validation parameters met the acceptance criteria established in the study. The percentages of recovered for cocaine and benzoylecgonine were 120 and 110% respectively. The method’s repeatability (CV %) remained below 15% in all assays. The technique was shown to be linear over the range studied (r2 = 0.999) and sensitive, with detection limits below 60 ng/mL for both analytes. In the analysis of two real samples 11 metabolites of cocaine were detected, benzoylecgonine and cocaetilene were the majorities. Furthermore, were detected and characterized metabolites which only are observed in the urine in overdose cases such as hydroxylated and metoxyhydroxylated metabolites of cocaine, benzoylecgonine and cocaethilene. The technique allowed detecting the cinnamoilbenzoilecgonina which is a metabolite of cinnamoilcocaína. The cinnamoilcocaína is one of the alkaloids in coca plants so the presence of this metabolite showed us natural cocaine consumption and not synthetic

Development and validation of an analytical method for the simultaneous determination of benzoylecgonine and ecgonine methyl ester in human urine by gas chromatography/mass spectrometry

A simple and rapid procedure has been developed and validated for the simultaneous determination of benzoylecgonine and ecgonine methyl ester in human urine samples. After extraction and sample cleanup by solid-phase extraction (SPE), the extracts were derivatized with 50 uL of MTBSTFA and analyzed by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). The limit of detection (LOD) was 50 ng/mL for both metabolites. The recoveries were 81% and 75.3% for benzoylecgonine and ecgonine methyl ester, respectively. The intra-assay precision (% relative standard deviation) at two different added amounts (200 and 1000 ng/mL) in urine matrix varied from 4.8 to 8.4 and from 4.4 to 5.7, respectively. The mass spectra obtained for each compound have many diagnostics ions with relative abundance in accordance with the WADA requirements.Colegio de Farmacéuticos de la Provincia de Buenos Aire

Development and validation of an analytical method for the simultaneous determination of benzoylecgonine and ecgonine methyl ester in human urine by gas chromatography/mass spectrometry

A simple and rapid procedure has been developed and validated for the simultaneous determination of benzoylecgonine and ecgonine methyl ester in human urine samples. After extraction and sample cleanup by solid-phase extraction (SPE), the extracts were derivatized with 50 uL of MTBSTFA and analyzed by gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS). The limit of detection (LOD) was 50 ng/mL for both metabolites. The recoveries were 81% and 75.3% for benzoylecgonine and ecgonine methyl ester, respectively. The intra-assay precision (% relative standard deviation) at two different added amounts (200 and 1000 ng/mL) in urine matrix varied from 4.8 to 8.4 and from 4.4 to 5.7, respectively. The mass spectra obtained for each compound have many diagnostics ions with relative abundance in accordance with the WADA requirements.Colegio de Farmacéuticos de la Provincia de Buenos Aire

Implementación de una técnica de Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas Triple Cuadruplo para detectar compuestos xenobióticos en muestras de orina para el control del dopaje.

La Agencia Mundial Antidopaje posee, entre sus funciones, la acreditación de los laboratorios dedicados al control del dopaje y para mantener esta categoría es necesario el cumplimiento de estándares internacionales. Una de las exigencias es el aumento constante de la sensibilidad de los ensayos y con ello el aumento de la capacidad analítica del laboratorio. El presente trabajo describe la introducción de un método instrumental para la detección de esteroides. Se validó el ensayo para 23 analitos, de ellos 21 esteroides anabólicos, un β2 agonista y un antiestrogénico. Los resultados del proceso de validación mostraron que el método propuesto es selectivo y preciso con variaciones intra-día entre 1-17 % para las concentraciones más bajas y entre 2,1-13,9 % para las más altas. Los límites de detección se mantuvieron entre 0,1-2,5 ng/mL excepto para el clenbuterol (0,02 ng/mL). El detector no mostró arrastre después del análisis de muestras concentradas, y los ensayos de recobrado y robustez fueron adecuados según el propósito que se persiga de pesquizaje o confirmación. Por último, la aplicación del ensayo validado a la evaluación de muestras provenientes de un estudio de excreción urinaria de metiltestosterona permitió ampliar la ventana de detección de este esteroide

Recuperación de columnas de extracción en fase sólida DetectabuseTM para la detección de esteroides anabólicos en el control doping

Las columnas DetectabuseTM han sido desarrolladas para la extracción cuantitativa de drogas a partir de fluidos biológicos; debido a su versatilidad y robustez son actualmente uno de los productos poliméricos más populares en la técnica de extracción en fase sólida. Una de las ventajas que presentan es la capacidad de extraer, de manera eficiente, una amplia variedad de compuestos que incluye las drogas de abuso más comunes, las de actividad terapéutica y esteroides excretados en forma libre y conjugada. La utilización de estas columnas en la preparación de muestras para la determinación de esteroides anabólicos y otros compuestos, tiene como objetivo disminuir las sales inorgánicas excretadas en la orina y aumentar con esto la eficiencia de la hidrólisis enzimática. Se presentan los resultados de la recuperación de estas columnas para su posterior utilización en procedimientos de tamizaje. El estudio se realizó con los compuestos siguientes: metenolona, boldenona, fluoximesterona, 3’-hidroxistanozolol, 19-norandrosterona, epimetendiol, clenbuterol, salbutamol, etamiván, dehidroepiandrosterona, ácido carboxílico del tetrahidrocannabinol, morfina, triamtereno, testosterona, epitestosterona, androsterona, etiocolanolona, 16,16,17-d3 testosterona y 17α-metiltestosterona y metabolitos de la metenolona, la boldenona, la bolasterona, la drostanolona, la mesterolona, la metandienona, del danazol y la metiltestosterona. Se compararon las abundancias absolutas y relativas de cada uno de los compuestos de la columna 1 con las recuperadas 2 y 3. Fueron determinadas la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación para cada compuesto. Se realizó una prueba F para análisis de varianzas y una prueba T de Student para análisis de medias

Characteristics of IEF, SDS and SAR-PAGE of Cuba EPO biosimilar

EPO is a glycoprotein produced in the kidney, which stimulates the division and differentiation of red cells in the bone marrow. Erythropoietin is available as a therapeutic agent produced by recombinant DNA technology in mammalian cell culture into which the human EPO gene has been transfected. Biosimilar Epoetins are mostly erythropoietins of the Epoetin alfa, beta or omega type, which are being produced at much lower cost due to expired patents. Recombinant human erythropoietin (rh-EPO) contains the identical amino acid sequence of natural EPO: 165 amino acids, with a molecular weight of 30,400 Da. Since glycosylation is not only dependent on the cell-line used for the expression of Epoetins but also on the entire biotechnological process the glycosylation patterns of biosimilars do not necessarily reflect the patterns of the originator compounds. Today biosimilar Epoetins are manufactured and distributed worldwide and under many different names. The use of recombinant EPOs for doping is prohibited because of its performance enhancing effect. The aim of the present study was to investigated whether biosimilar alpha r-HuEPO – ior®-EPOCIM, produced in Cuba and also available in other countries in all continents, could be differentiated from endogenous one by iso-electro-focusing plus double blotting, SDS-PAGE and SAR-PAGE for antidoping analysis